ESCUELA DE DOCTORADO

 
Tesis Doctorales de la Universidad de Alcalá
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SELECCIÓN IN VITRO DE APTÁMEROS DE DNA Y RNA FRENTE A LA PROTEÍNA CORE DEL VIRUS DE LA HEPATITIS C: APLICACIONES EN DIAGNÓSTICO Y TERAPIA
Autor/aTorres Vázquez, Beatriz
DepartamentoBiología de Sistemas
Director/aBriones Llorente, Carlos
Codirector/aMoreno Molina, Miguel
Fecha de defensa20-07-2022
CalificaciónSobresaliente cum laude
ProgramaCiencias de la Salud (RD 99/2011)
Mención internacionalNo
ResumenLos aptámeros son ácidos nucleicos de cadena sencilla (RNA o ssDNA) que, gracias a su estructura tridimensional en solución, pueden unirse a un amplio rango de dianas (desde moléculas pequeñas hasta células y tejidos) con alta afinidad y especificidad. Se obtienen mediante selección in vitro utilizando un procedimiento llamado SELEX y constituyen herramientas moleculares prometedoras en biotecnología y biomedicina (por ejemplo, para el diagnóstico y terapia de enfermedades infecciosas). El virus de la hepatitis C (VHC) causa hepatitis crónica, que puede progresar hacia fibrosis, cirrosis e incluso carcinoma hepatocelular. Los tests de diagnóstico actuales se basan principalmente en ensayos serológicos que detectan anticuerpos anti-VHC producidos por los pacientes infectados, así como en ensayos moleculares que cuantifican el RNA genómico viral en plasma o suero. Sin embargo, se requieren herramientas analíticas más rápidas, baratas y sensibles para el diagnóstico y terapia. La proteína core del VHC es una diana de gran interés: es la proteína más conservada del virus, es la primera que se sintetiza durante la traducción del genoma viral y ejerce funciones importantes en el ciclo de vida del virus, entre ellas la encapsidación y protección de su genoma. En esta Tesis se han seleccionado in vitro aptámeros de ssDNA y RNA frente a diferentes variantes de la proteína core del VHC que pertenecen a los genotipos 1 a 4. Tras realizar de 9 a 14 rondas de SELEX, los aptámeros individuales presentes en las poblaciones enriquecidas fueron analizados por secuenciación Sanger y secuenciación masiva (UDS), y las constantes de afinidad (Kd) fueron cuantificadas mediante ELONA colorimétrico y ELONA-qPCR (para aptámeros de DNA) o ELONA-RTqPCR (para aptámeros de RNA). El análisis bioinformático mostró que el aptámero de DNA AptD-1312 estaba altamente representado en todos los procesos de selección y su secuencia compartía motivos de secuencia con otras que habían sido seleccionadas solamente frente a algunas variantes de la proteína core del VHC. Además, tanto AptD-1312 como AptD-1932 presentaron la mayor afinidad (con Kds en el rango nanomolar bajo) y especificidad por la proteína core del VHC. El aptámero AptD-1312 se utilizó como sonda de bio-reconocimiento en un aptasensor basado en grafeno que detecta la proteína core de VHC en plasma en el rango attomolar, convirtiéndose en un biosensor ultrasensible de gran utilidad para el diagnóstico clínico. Además, los dos aptámeros de mayor prevalencia y alta afinidad (AptD-1312 y AptD-1932) fueron analizados en cultivo celular humano infectado con VHC, produciendo una inhibición de la producción de progenie viral, un descenso de los niveles de RNA extracelular y una acumulación del RNA viral intracelular. Tales resultados revelan su capacidad para unirse a la proteína core e inhibir el ensamblaje de la cápsida del VHC en cultivo celular, impidiendo así la formación y liberación de viriones infecciosos. Esto sugiere una futura aplicación clínica como fármacos antivirales, complementarios o alternativos los utilizados actualmente en el tratamiento de la hepatitis C.