| Tesis Doctorales de la Universidad de Alcalá |
| OBTENCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE PÉPTIDOS CON PROPIEDADES HIPOCOLESTEROLÉMICAS A PARTIR DE HUESOS DE ACEITUNA. EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTE NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS DENDRONIZADAS | | Autor/a | Prados Nieto, Isabel María | | Departamento | Química Analítica, Química Física e Ingeniería Química | | Director/a | García López, María Concepción | | Codirector/a | Marina Alegre, María Luisa | | Fecha de defensa | 23-03-2023 | | Calificación | Sobresaliente cum laude | | Programa | Química (RD 99/2011) | | Mención internacional | Sí | | Resumen | La obtención de compuestos bioactivos a partir de residuos de la industria agroalimentaria constituye una gran oportunidad tanto desde el punto de vista científico como económico y social. Por una parte, es posible utilizar los compuestos con actividad biológica obtenidos para mejorar la salud de las personas a través de su inclusión como ingredientes en la elaboración de alimentos funcionales, nutracéuticos o productos cosméticos, entre otros. Por otra parte, el aprovechamiento de los residuos de la industria agroalimentaria reduce su impacto negativo sobre el medioambiente al evitar su llegada a vertederos o incineradoras. Al mismo tiempo, la reutilización de dichos residuos disminuye el coste de su eliminación aportando recursos económicos derivados de la incorporación de los compuestos bioactivos obtenidos en otras cadenas de producción y generando, por tanto, riqueza en la industria relacionada e impulsando la economía circular.
Existen diferentes compuestos bioactivos de interés que están presentes en los residuos de la industria agroalimentaria. Entre ellos, es posible destacar los péptidos bioactivos por la gran variedad de actividades biológicas que pueden poseer. Los péptidos bioactivos pueden estar presentes de forma natural en un alimento o residuo o bien se pueden obtener mediante la hidrólisis de las proteínas contenidas en dichas matrices.
Una de las bioactividades de mayor interés en la actualidad es la capacidad de reducir el colesterol ya que altos niveles de colesterol en sangre están relacionados con un aumento de las enfermedades cardiovasculares como la enfermedad coronaria o la ateroesclerosis. Sin embargo, los péptidos con actividad hipocolesterolémica han sido descritos con mucha menos frecuencia que otros con otras bioactividades a pesar de la relevancia que presentan como alternativa a los fármacos desarrollados para el tratamiento de la hiperlipidemia. Estos fármacos no solo pueden dar lugar a efectos secundarios sino que en general, actúan siguiendo un único mecanismo.
Trabajos preliminares de nuestro grupo de investigación habían demostrado que los hidrolizados de proteínas extraídas de semillas de oliva presentaban capacidad para reducir la solubilidad micelar del colesterol. Ello ha motivado que esta Tesis Doctoral se centre en la obtención de péptidos con actividad hipocolesterolémica a partir de semillas de oliva. Para ello, se han desarrollado distintas estrategias para la extracción de proteínas, la obtención de hidrolizados peptídicos, su caracterización in vitro e in vivo y la identificación de péptidos con potencial actividad hipocolesterolémica a partir de semillas de la oliva, siempre buscando incrementar la sostenibilidad de los procesos.
El Capítulo III de esta memoria describe la obtención, caracterización e identificación de péptidos a partir de extractos proteicos de semillas de oliva con capacidad para limitar la digestión y la absorción de lípidos siguiendo múltiples mecanismos. La extracción de las proteínas se llevó a cabo utilizando ultrasonidos focalizados de alta intensidad y para la hidrólisis de las mismas se empleó la enzima Alcalasa. Los hidrolizados se fraccionaron y se evaluó la actividad hipolipidémica tanto de los hidrolizados como de las fracciones obtenidas. Para ello, se emplearon cuatro ensayos in vitro diferentes basados en la medida de la capacidad de los péptidos para reducir la absorción del colesterol exógeno (capacidad para reducir la solubilidad micelar del colesterol, para inhibir la actividad de la enzima colesterol esterasa pancreática y para enlazar ácidos biliares) y de los triglicéridos (capacidad para inhibir la actividad de la enzima lipasa pancreática). La caracterización de los péptidos incluyó, asimismo, el estudio de la resistencia de los mismos a la digestión gastrointestinal y la evaluación de su citotoxicidad. El fraccionamiento por ultrafiltración seguido de RP-HPLC semipreparativo permitió seleccionar una fracción que destacó por el hecho de que los péptidos que contenía mostraron simultáneamente capacidad para reducir la solubilidad del colesterol en micelas y para inhibir las enzimas colesterol esterasa y lipasa pancreáticas, incluso tras su digestión gastroinstestinal simulada. Los péptidos presentes en esta fracción se separaron e identificaron mediante RP-HPLC-ESI-Q-TOF tras la optimización de las condiciones experimentales para llevar a cabo dicha separación. Se identificaron 10 péptidos que contenían entre 4 y 9 aminoácidos destacando el alto nivel de ácidos glutámico y aspártico en sus secuencias.
Una vez demostrado que los péptidos obtenidos mediante hidrólisis con la enzima Alcalasa de las proteínas contenidas en la semilla de oliva presentaban capacidad hipocolesterolémica multifuncional en ensayos in vitro, en el Capítulo IV se procedió a profundizar en su caracterización mediante la realización de dos ensayos in vivo con ratones machos y hembras empleando dos hidrolizados peptídicos de concentraciones diferentes y un ensayo in vitro adicional que evaluaba la capacidad para inhibir la biosíntesis de colesterol endógeno (inhibición de la enzima reductasa HMG-CoA). Los resultados permitieron poner de manifiesto que ambas concentraciones de péptidos causaban una disminución del colesterol total en la sangre de los ratones, si bien dicha reducción era mayor para la concentración de péptidos más alta. Asimismo, se llevó a cabo la identificación de los péptidos potencialmente responsables de esta actividad hipocolesterolémica in vivo mediante RP-HPLC-ESI-Q-TOF.
Con el fin de evaluar la relación entre el perfil peptídico y las propiedades hipocolesterolémicas de los hidrolizados obtenidos a partir de las semillas de oliva mediante la enzima Alcalasa, así como investigar el efecto que la variedad de oliva empleada podía tener sobre la capacidad hipocolesterolémica de los extractos, en el Capítulo V se llevó a cabo un estudio con veinte variedades diferentes de oliva (Barnea, Bouteillan, Caballo, Cañivano Negro, Cobrancosa, Corbella, Cordobeses de Arroyo de la Luz, Cornicabra, Kalokerida, Khalkali, Lechín de Sevilla, Medjhoul, Nevado Azul, Ocal, Picual, Racimal de Jaén, Reixonenca, Sayfi, Verdiel y Manzanilla). La extracción de las proteínas a partir de las semillas de oliva se llevó a cabo utilizando ultrasonidos focalizados de alta intensidad. Los péptidos obtenidos mediante hidrólisis con la enzima Alcalasa se identificaron utilizando técnicas proteómicas y se evaluaron sus capacidades para reducir la absorción del colesterol procedente de la dieta (mediante la inhibición de la enzima colesterol esterasa, el enlace a ácidos biliares y la reducción de la solubilidad del colesterol micelar) o la biosíntesis del colesterol endógeno. Todas las variedades de oliva permitieron obtener péptidos con distintas capacidades para reducir el colesterol pero el genotipo influyó de forma determinante en sus características hipolipidémicas. La aplicación de técnicas estadísticas univariantes y multivariantes permitió demostrar la existencia de fuertes correlaciones, tanto positivas como negativas, entre la presencia de ciertos péptidos en los hidrolizados y su capacidad para reducir la absorción del colesterol exógeno y la biosíntesis del colesterol endógeno, demostrando por primera vez la relevancia de la variedad de oliva en las características hipolipidémicas de sus extractos peptídicos.
Otra variable importante para la obtención de péptidos hipolipidémicos de la semilla de oliva es la enzima empleada en la hidrólisis de los extractos proteicos. Por ello, en el Capítulo VI se investigó el potencial de cuatro enzimas nuevas (Maxipro AFP, Maxipro FPC, Maxipro BAP y Maxipro NPU) que cubrían el intervalo de pH comprendido entre 2.5 y 9.0. Se utilizó un diseño experimental Box-Behnken para evaluar el efecto que el tiempo de hidrólisis, el pH, la temperatura y la relación enzima:sustrato ejercían sobre la cantidad de péptidos obtenidos a partir de extractos proteicos de semilla de oliva de la variedad Picual. En las condiciones óptimas fue la enzima Maxipro BAP la que permitió obtener una mayor cantidad de péptidos mientras que la producción más baja de péptidos se correspondió con el empleo de la enzima Maxipro FPC. Se evaluó la capacidad de los hidrolizados obtenidos con las nuevas enzimas para reducir la absorción del colesterol exógeno y la biosíntesis de colesterol endógeno lo que puso de manifiesto que todos los hidrolizados presentaban una mayor capacidad para enlazar ácidos biliares y para inhibir la enzima colesterol esterasa que el hidrolizado obtenidos con la enzima Alcalasa. Especialmente interesante fue la enzima Maxipro AFP ya que mostró la mayor capacidad hipocolesterolémica en comparación con las otras enzimas Maxipro y la enzima Alcalasa, utilizando condiciones de pH ácido. Los péptidos en los hidrolizados se identificaron mediante análisis proteómico basado en el empleo de RP-HPLC-ESI-QTOF permitiendo observar secuencias con características hipocolesterolémicas entre los 45 peptidos identificados en el hidrolizado con la enzima Maxipro AFP, los 56 peptidos identificados en el hidrolizado con Maxipro BAP, y los 50 obtenidos con la enzima Maxipro FPC.
Teniendo en cuenta el potencial demostrado por las semillas de oliva en los trabajos de investigación llevados a cabo en esta Tesis Doctoral para obtener péptidos con características hipolipidémicas a partir de sus extractos proteicos, se consideró de gran interés desarrollar una nueva estrategia para extraer las proteínas de las semillas de oliva que permitiera incrementar la sostenibilidad de los procedimientos existentes hasta la fecha. Por ello, el Capítulo VII se centró en el empleo de nanopartículas magnéticas (MNPs) (basadas en magnetita, Fe3O4), tanto sin modificar como modificadas con dendrones carbosilano, para proponer una nueva aproximación verde y reutilizable para este fin. Las MNPs se modificaron con dendrones carbosilano de primera y segunda generación con grupos terminales carboxilato. Se investigaron las interacciones entre las MNPs, sin modificar y modificadas con dendrones, y varias proteínas (albúmina de suero bovino (BSA), lisozima (LYS), mioglobina (MYO) y concanavalina (CONC)) con distintas características (masa molecular y carga). Dichas interacciones variaron considerablemente con el pH, el tipo de proteína y la generación de dendron utilizado para modificar las MNPs. También se optimizó la relación molar dendrón:proteína y las condiciones para romper las interacciones entre las proteínas y las MNPs después de llevar a cabo su extracción. Esta última etapa constituye el principal inconvente de otros métodos desarrollados que no permiten recuperar las proteínas y las MNPs por separado. Las MNPs modificadas con dendrones de segunda generación demostraron capacidad para retener al 100% todas las proteínas estudiadas para lo que fue necesario la utilización de condiciones ácidas. El empleo de SDS al 0.2 % a 100 °C durante 10 min permitió romper las interacciones proteína-MNP lo que permitía reutilizar las MNPs sin perder sus características magnéticas ni su capacidad de interacción con las proteínas. Las MNPs modificadas con dendrones carbosilano con grupos terminales carboxilato propuestas en esta Tesis Doctoral demostraron su potencial para extraer proteínas a partir de semillas de oliva y también de otros subproductos de la industria agroalimentaria como el suero de queso.
Los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral constituyen un conjunto de metodologías avanzadas para la obtención de hidrolizados peptídicos multifuncionales con características hipolipidémicas a partir de extractos de semillas de oliva. Asimismo, se ha desarrollado una nueva estrategia para extraer proteínas basada en el empleo de nanopartículas magnéticas modificadas con dendrones carbosilano con grupos terminales carboxilato que ha demostrado un gran potencial para extraer proteínas de muestras complejas como son las semillas de oliva o el suero de queso permitiendo la reutilización de las nanopartículas y, por tanto, incrementando la sostenibilidad del proceso. El empleo de subproductos de la industria agroalimentaria para obtener compuestos bioactivos de alto valor y potencial aplicación en las industrias alimentaria, cosmética, nutraceútica o química, constituye una vía de alto interés para impulsar la economía circular reduciendo el impacto económico y medioambiental derivado de la eliminación de dichos residuos. Además, la obtención y caracterización in vitro e in vivo de los compuestos bioactivos obtenidos permite poner a disposición de la sociedad un conjunto de sustancias con potenciales beneficios sobre la salud. |
|
