| Tesis Doctorales de la Universidad de Alcalá |
| MOLECULAR DETERMINANTS FOR FAK ACTIVATION AND REGULATION BY INTRINSIC AND C-SRC-DRIVEN MECHANISMS | | Autor/a | Astudillo Silva, Yanara | | Departamento | Biología de Sistemas | | Director/a | Plaza Menacho, Iván | | Fecha de depósito | 26-01-2026 | | Periodo de exposición pública | 27 de enero a 10 de febrero de 2026 | | Fecha de defensa | Sin especificar | | Programa | Señalización Celular (RD 99/2011) | | Mención internacional | No | | Resumen | La quinasa de adhesión focal (FAK) es una tirosina quinasa no receptora que desempeña un papel clave en los procesos celulares como la migración, la supervivencia y el crecimiento, en respuesta a las señales iniciadas por las integrinas y los factores de crecimiento. La activación y regulación de FAK se ha documentado ampliamente como un mecanismo bien organizado que involucra la fosforilación de residuos específicos e interacciones complejas con otras proteínas que involucran grandes cambios conformacionales y la formación de complejos macromoleculares, que en conjunto controlan la transición de estados inactivos a activos de FAK. Sin embargo, los determinantes estructurales y moleculares que definen dichos estados catalíticos inactivos y competentes aún no están bien definidos, en particular aquellos relacionados con el mecanismo de autoactivación y autorregulación. Además, tampoco se comprenden bien los detalles finos sobre cómo estos interruptores intrínsecos son modulados por otras quinasas de señalización que ensamblan complejos macromoleculares con FAK (por ejemplo, c-Src).
En esta tesis, se diseñaron y generaron variantes recombinantes de FAK humano en células de insectos utilizando baculovirus, incluida la proteína de longitud completa, y una serie de dominios aislados y combinaciones específicas de ellos para su caracterización funcional y estructural. Mediante espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) se identificaron múltiples sitios de autofosforilación, incluidos la Tyr 155, Tyr 347, Tyr 397, Tyr 861 y Tyr 925. Además, un fragmento del dominio FERM que contiene la Tyr 397 (1-405 aa) funciona como un sustrato adecuado y robusto para realizar estudios funcionales, demostrando su valor como herramienta para caracterizar la activación y regulación catalítica de FAK. Esta herramienta también se utilizó para la identificación de quinasas oncogénicas capaces de fosforilar directamente a FAK, por ejemplo, CCDC6-RET, KIF5B-RET, RI-RET. Además, se llevó a cabo una caracterización detallada de la interacción entre FAK y c-Src que reveló características inesperadas y determinantes no conocidos anteriormente, como la especificidad de c-Src por la Tyr 577 (en lugar de Tyr 576 o ambos sitios) en el bucle de activación de FAK y la Tyr 1007 del dominio FAT; y que la interacción "recíproca" entre FAK y c-Src resultó en un aumento alostérico en los niveles de fosforilación de c-Src en la Tyr 530.
Paralelamente, varios modelos estructurales de FAK fueron generados por inteligencia artificial (AlphaFold). Estos modelos no solo capturaron estados funcionales ya conocidos, como la conformación autoinhibida previamente observada por cristalografía, sino que también generaron nuevas hipótesis y modelos de prueba de concepto que respaldan los datos funcionales sobre cómo los dominios adyacentes al núcleo catalítico de FAK juegan funciones que no se conocían ni se contemplan en el paradigma actual.
Finalmente, el cribado de una biblioteca de inhibidores de moléculas pequeñas contra el dominio quinasa de FAK identificó tres compuestos candidatos: ETP-41634, ETP-53999 y ETP-48879. Los análisis de acoplamiento in silico y de simulación de dinámica molecular predijeron diferentes perfiles de interacción, en los que ETP-53999 presentó la unión más estable, en concordancia con su actividad ya conocida como inhibidor específico de FAK. Estos resultados se complementaron y validaron mediante la resolución de la estructura cristalina del dominio quinasa de FAK en complejo con ETP-51634 a 1,5 Å.
En conjunto, el trabajo presentado en esta tesis proporciona una visión más precisa de la regulación a nivel molecular y funcional de FAK, proponiendo nuevos mecanismos de activación y regulación, así como vías alternativas para la inhibición selectiva, |
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