| Tesis Doctorales de la Universidad de Alcalá |
| GENERACIÓN DE CÉLULAS CAR-T MEDIANTE INTEGRACIÓN NO VIRAL BASADA EN VECTORES TIPO DOGGYBONE Y LA TRANSPOSASA SLEEPING BEAUTY FRENTE A LINFOMAS B AGRESIVOS | | Autor/a | Guerrero Amelín, Carolina | | Departamento | Biología de Sistemas | | Director/a | Mateos Gómez, Pedro Antonio | | Codirector/a | Serrano López, Juana | | Fecha de defensa | 16-07-2026 | | Calificación | Sobresaliente cum laude | | Programa | Señalización Celular (RD 99/2011) | | Mención internacional | No | | Resumen | El linfoma difuso de células B grandes (LDCBG) es la neoplasia linfoide agresiva más frecuente en adultos y continúa siendo un importante problema clínico, ya que una proporción relevante de pacientes recaen o son refractarios tras el tratamiento estándar con esquemas de quimioinmunoterapia como R CHOP. La terapia con células T con receptor quimérico de antígeno (CAR T) ha mejorado de forma notable el pronóstico de estos pacientes, pero su aplicación presenta limitaciones por la dependencia de los vectores virales, los cuales no solo elevan de manera notable los costes de fabricación de dichas células, sino que también conllevan riesgos de seguridad como inserciones genotóxicas. En este contexto, resulta necesario desarrollar plataformas no virales que reduzcan los costes de generación de las CAR-T e incrementen la seguridad, para hacer más accesible este tipo de tratamiento con células CAR T frente a linfomas B agresivos.
El objetivo de esta tesis fue estudiar el potencial de la combinación de vectores de ADN lineales tipo doggybone con la transposasa Sleeping Beauty como una plataforma no viral eficaz, capaz de logar niveles de expresión y funcionalidad comparables a los obtenidos con vectores lentivirales. En este trabajo se usaron moléculas CAR dirigidas frente a CD79b, un antígeno potencialmente relevante en linfomas B. Para ello se diseñaron y construyeron diversos transposones de Sleeping Beauty que además de incorporar la molécula CAR anti‑CD79b, también portaban diferentes configuraciones en cuanto a marcadores de fluorescencia, promotores y elementos bicistrónicos. A partir de estas construcciones se generaron vectores tipo doggybones y se evaluó su comportamiento en los modelos celulares HEK293T y Jurkat, que deriva de linfocitos T. En el primer modelo, se comparó la eficiencia de los distintos diseños del transposón de Sleeping Beauty, se determinó la relevancia de la actividad de esta enzima y se evaluó la estabilidad de la expresión de marcadores fluorescentes y de la molécula CAR a largo plazo. En el modelo Jurkat, mediante ensayos de formación de sinapsis inmunológicas y de crecimiento de células diana, se comparó la actividad de dos moléculas CAR anti-CD79b y la eficiencia de la plataforma Sleeping Beauty/doggybone frente a un sistema lentiviral.
Los resultados mostraron que los vectores doggybone son compatibles con el sistema Sleeping Beauty, permitiendo una integración estable y una expresión sostenida de EGFP y de la molécula CAR. Además, el diseño más eficaz fue el de un transposón con menor tamaño y que incorporaba la secuencia IRES. Las células Jurkat CAR establecían sinapsis inmunológicas específicas, además de mostrar que la molécula CARLY2 tenía más actividad que CARLY1 frente a las células diana SU-DHL-4. Finalmente, se observó una actividad equiparable en las células CAR obtenidas tanto mediante la plataforma Sleeping Beauty/doggybone como con el sistema lentiviral. En conjunto, esta tesis valida la combinación de doggybones y Sleeping Beauty como una estrategia no viral robusta para la generación de células CAR T dirigidas frente a CD79b, lo que abre la posibilidad de desarrollar procesos de fabricación más sencillos y de menor coste para terapias CAR T en linfomas B agresivos. |
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