ESCUELA DE DOCTORADO

 
Tesis Doctorales de la Universidad de Alcalá
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NUEVAS APORTACIONES EN LA CARACTERIZACIÓN, CULTIVO Y TRATAMIENTO EN ACANTHAMOEBA SPP
Autor/aMartin Perez, Tania
DepartamentoBiología de Sistemas
Director/aPérez Serrano, Jorge
Codirector/aCriado Fornelio, Ángel Luis
Fecha de defensa19/02/2020
CalificaciónSobresaliente Cum Laude
ProgramaCiencias de la Salud (RD 99/2011)
Mención internacionalSi
ResumenLas amebas de vida libre (AVL) del género Acanthamoeba son patógenos o parásitos oportunistas siendo los agentes etiológicos de la encefalitis granulomatosa amebiana (EGA), queratitis amebiana (QA) y amebiasis cutánea. Las cepas de este género se clasifican en 20 genotipos diferentes (T1 - T20). En los últimos años, el número de casos de encefalitis amebiana granulomatosa y, sobre todo, de queratitis amebiana han aumentado, debido a la mejora de las herramientas diagnósticas y un mayor conocimiento del personal sanitario sobre este parásito. En la mayoría de estos casos el genotipo al que pertenece la cepa Acanthamoeba aislada es el T4. Ambas patologías tienen un tratamiento problemático debido a la falta de fármacos eficaces o por la forma de resistencia de la ameba (quistes) o por el retraso en el diagnostico ya que la sintomatología es común a otras patologías. Por estos motivos, en los últimos años se ha estudiado la eficacia de una gran variedad de distintos compuestos, tanto de origen químico como natural. Para realizar este tipo de ensayos (cribado de fármacos) es necesario el aislamiento de las amebas y posterior cultivo en medio axénico (cultivo formado por una única especie de microorganismo). Además, una identificación del genotipo al que pertenece el aislado es recomendable, ya que, los aislados diferentes al genotipo T4 muestran una mayor resistencia a los fármacos que los aislados del genotipo T4. En más del 80 % de muestras procedentes de pacientes se detectó Acanthamoeba spp., mientras que en las muestras de las aguas de limnoembalses estudiados sólo se aisló Acanthamoeba spp. en un 9,6 %. Estos aislados se cultivaron en los medios axénicos habituales (PYG suplementado con 2 % de bactocasitona y CERVA) para realizar la identificación del genotipo, estudio de la patogenicidad y ensayos in vitro de cribado de compuestos posiblemente amebicidas. De las 10 cepas aisladas, sólo una (ISCIII-UAH 66/14) no creció en los medios tradicionales. Así pues, se diseñaron empíricamente medios de cultivo indefinidos basados en ingredientes habituales en los supermercados para intentar establecer un cultivo de ISCIII-UAH 66/14. Estos medios se nombraron medio 1, medio 2 y así sucesivamente hasta el medio 80, todos ellos se probaron en todas las cepas presentes en el laboratorio de parasitología de la UAH, el crecimiento se comprobó por placas sensibles a oxígeno (OCR) y por microscopio óptico. Se observó crecimiento en todas las cepas, incluso la cepa ISCIII-UAH 66/14, en los medios 39 y 80. Una vez establecidos los cultivos axénicos, se determinó el genotipo de los aislados clínicos y ambientales. La mayoría de estos, pertenecen al genotipo T4, una muestra clínica es T3 (ISCIII-UAH 66/14) y dos muestras ambientales son T2 (P-UAH-O3 y PV-UAH-V2). También se analizaron los factores de patogenicidad, pero no se observaron claras diferencias entre las cepas clínicas (teóricamente patógenas) y las ambientales (teóricamente no patógenas). Por último, se estudió el efecto amebicida del dimetilsulfóxido (DMSO), aceite del árbol del té (TTO), nanopartículas, dendrones y dendrímeros sobre trofozoítos de dos cepas clínicas con distinto genotipo (A. polyphaga 2961 ¿ T4 y A. griffini MYP2004 ¿ T3). Se comprobó que la combinación de DMSO y TTO tiene un gran efecto amebicida, pero es citotóxico en células humanas (células epiteliales de cornea y HeLa). De los sistemas dendríticos estudiados, los que mayor eficacia mostraron fueron BDTL072 y BDTL073 y no presentan citotoxidad en células humanas. Ambos son dendrímeros catiónicos carbosilanos cuyos grupos funcionales son biguanidas.