ESCUELA DE DOCTORADO

 
Tesis Doctorales de la Universidad de Alcalá
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MODELO ANIMAL DE DEGENERACIÓN RETINIANA INDUCIDA POR EXCITOTOXICIDAD. EVALUACION DE AGENTES NEUROPROTECTORES Y TERAPEUTICOS
Autor/aCalvo Llamas, Estrella
DepartamentoBiología de Sistemas
Director/aVilla Polo, Pedro de la
Codirector/aGermain Martínez, Francisco José
Fecha de defensa18/05/2018
CalificaciónSobresaliente Cum Laude
ProgramaCiencias de la Visión (RD 99/2011)
Mención internacionalNo
ResumenEl desarrollo de modelos animales con degeneración en las células ganglionares de la retina (CGR) ha sido ampliamente estudiado. En los últimos años, el uso de agonistas del glutamato tales como el ácido kaínico (KA) o el N -metil- D -aspártico (NMDA) se han utilizado como agentes lesivos de manera selectiva en las CGR. Sin embargo, la información sobre el efecto de estos agentes neurotóxicos en otros tipos de células, así como el daño funcional generado en la retina, no se ha definido claramente. La utilización de fármacos neuroprotectores, entre los que se encuentran los agonistas ¿-adrenérgicos como la brimonidina, durante el proceso degenerativo celular, o previo a él, abre un camino ante posibles tratamientos para revertir o minimizar el daño celular. Nuestro trabajo estudia el efecto neurotóxico de KA y NMDA sobre las células de la retina interna y su efecto en la función retiniana, con el objetivo de desarrollar un modelo experimental de degeneración celular por agentes lesivos que sea fiable y reproducible para el estudio de tratamientos neuroprotectores. El proceso neurotóxico en la retina fue inducido en ratones C57BL6 mediante inyección intraocular en el ojo derecho de 1 µl de PBS con concentraciones crecientes de KA y NMDA. El ojo izquierdo se utilizó como ojo control y fue inoculado con 1µl de PBS. Las CGR se marcaron con anticuerpos contra Brn3a en retinas montadas en plano tras dos semanas de las inyecciones de KA y / o NMDA, y la densidad de CGR se estimó en diferentes áreas de la retina mediante recuento manual de células. El estudio de la funcionalidad de la retina se abordó mediante registros binoculares estándar de electrorretinograma (ERG) de flash una semana después de la inyección intraocular de agentes neurotóxicos. El efecto estructural generado se observó en secciones transversales de retina inmuno-reactivas para células bipolares (anticuerpo contra ¿PKC) y células ganglionares (anticuerpo contra Brn3a) y se marcaron los núcleos celulares con DAPI para la diferenciación de las capas celulares de la retina. El marcaje anterógrado de la vía visual, se realizó mediante inyección intraocular de 1 µl de colerotoxina (CTX) en ambos ojos, con distintas emisiones de luz para su comparación (CTX 488 con emisión en verde se utilizó en el OD y CTX 555 con emisión en rojo en el OI). Tras el recuento celular se demostró que la inyección de KA y/o NMDA induce la muerte selectiva de CGR cuando se inyecta en el ojo, produciendo una clara disminución de la densidad de CGR en comparación con los ojos controles. El efecto de KA y NMDA era dependiente de la dosis y cuando se inyectaron de manera conjunta se observó una potenciación de la muerte de CGR. En la evaluación funcional de la retina se observó una atenuación clara de las amplitudes de onda b del ERG, tanto en condiciones escotópicas como fotópicas en los ojos inyectados con KA / NMDA. No se observó disminución significativa de la amplitud de la onda a en estos ojos indicando de este modo el daño de las células de la retina interna y la preservación de las células fotorreceptoras. El estudio inmunocitoquímico no demostró efectos nocivos en la capa de células fotorreceptoras y células bipolares, sin embargo, se observó una disminución en las capas de células nucleares de la retina interna, lo que indica que la mezcla de KA y NMDA es capaz de inducir la muerte no sólo de CGR, sino también de células situadas en la capa nuclear interna (células bipolares presumiblemente de conos y células amacrinas) y la capa de células ganglionares (CGR y células amacrinas desplazadas).